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茶皂素的溶血與魚毒作用Ⅴ.茶皂素的溶血與魚毒作用 朱全芬 夏春華 樊興土 柳榮祥 田潔華 王路 唐麗萍 （中國農業科學院茶葉研究所，杭州310008） 摘 要 對魚、蝦、雞及人體的離體血液和魚、蝦活體及血液的顯微觀察比較研究結果表明，茶皂素對血液中的紅細胞都有溶血作用，而對藍細胞和蝦血細胞則無作用。對紅細胞的毒性作用主要表現在破壞細胞膜而使細胞質外滲，導致紅細胞解體。對魚類的毒性，主要是通過破壞魚鰓的上皮細胞而進入鰓血管和心臟，使血液中的紅細胞產生溶血。茶皂素的溶血率曲線“S”型，即溶血不是勻速的，而是在某一段時間里特別快。達到每毫升標準血球懸浮完全溶解約需純茶皂素30μg。茶皂素的溶血速度隨其稀釋倍數的縮小而加快。茶皂素的溶血指數為100000。 關鍵詞：茶皂素，魚毒活性，溶血性，對蝦，魚 前 言 前三報的研究結果表明，魚、蝦雖同為鰓呼吸，但茶皂素對魚類具有明顯的魚毒作用，而對蝦的毒性很小，且在一定濃度范圍內尚有促進生長的作用。茶皂素的毒性機理是什么？已知茶皂素對冷血動物具有致死的毒性，對血液具有溶血作用。為進一步揭示茶皂素的魚毒活性的作用過程、茶皂素的魚毒活性與溶血性之間的關系，特對茶皂素的溶血效應和茶皂素作用下的魚、蝦等不同生物的血液及活體組織的變化進行了細胞學的觀察比較研究。 材料與方法 1. 供試藥劑：茶皂素Ⅰ（見前報）。 2. 魚：體長8—60mm鱉條。 3. 對蝦：體長90—100mm的刀額新對蝦。 4. 供試血液：離體鯉魚血、人血、雞血及對蝦心臟血液。血樣的采集：用醫用針筒，分別從鯉魚的主動脈和雞翅膀的靜脈抽樣魚血和雞血；用醫用微量吸血管從指尖采集人血；用針刺取得活對蝦心臟的血液。 5. 顯微觀察和攝影儀器：上海光學儀器廠生產的ZXCⅣ生物顯微鏡和江西光學儀器總廠生產的XZ—1顯微照相儀。 （二） 方法 1. 茶皂素的溶血性觀察 將離體的各種血液制成血膜。操作方法：取一干凈無油脂的載玻片，滴上一滴剛獲得的新鮮血液，推成血膜，置空氣中自然凝固干燥。血膜制成后，在膜一半處，加滴一小滴茶皂素溶液，采用推血膜的辦法，將溶液均勻涂于血膜半面，干燥后再以瑞氏（Wright）或吉姆氏(Gimas)染色劑染色,經阿拉伯樹膠封片,而后進行顯微照相記錄。 2.不同條件下魚體組織比較 采用1L的玻璃燒杯，加入1000ml溶液培養。試驗設10、50和100mg/L三種不同茶皂素濃度。將在茶皂素溶液中培養至嚴重中毒和致死的魚體組織及鰓血、心臟血細胞，與未經茶皂素處理自然死亡的魚體組織和血細胞比較。魚鰓在未染色固定前先進行觀察記錄其自然狀態，然后再將樣本進行染色固定。 對在10mg/L茶皂素溶液中培養至近死亡的魚和未加茶皂素培養的魚，用顯微鏡透光觀察各部位差異，并進行顯微照相記錄。 3.不同培養條件下對蝦組織的比較 采用50L容量的聚氧乙烯桶培養，總溶液30升。試驗設15‰鹽水和20mg/L的15‰鹽度溶液兩種處理。培養過程中兩種處理的蝦均成活正常，經3h后未出現異常,取其鰓進行顯微觀察。另制片進行鰓、鰓血細胞和心臟血細胞染色固定，顯微照相記錄。 4.茶皂素的溶血效應試驗 （1）茶皂素的溶血率曲線和時間—稀釋率曲線測定 由于溶血試驗所需血量大，本試驗采用雞血的紅細胞為材料進行研究，以確保試驗的可比性。用檸檬酸鈉作抗凝劑，1%氯化鈉等滲液3次洗滌血液，配置成標準血球懸浮液，即1ml血液所得之血球懸浮于20ml的1%氯化鈉溶液中。 利用紅細胞溶血前后透明度的變化，根據體系的透光度（T），間接反映茶皂素對紅細胞的溶血作用過程。
（2）茶皂素溶血當量的測定，即每毫升標準血球懸浮液所消耗的固體茶皂素量的測定（mg/ml）利用紅細胞在未溶血前，靜止沉淀后上清液為無色，溶血后帶紅色的電解質在上清液中，其顏色深淺與皂素溶血程度成正比的原理，從溶血后上清液吸光率的變化作茶皂素溶血的標準曲線，并通過偏離標準曲線的點，推算茶皂素對標準血球懸浮液的溶血當量。 結果及分析 1. 茶皂素的溶血性 通過鯉魚、雞和人體3種血膜茶皂素處理比較（圖版Ⅰ：1—3）可以看出， 茶皂素對紅細胞都有溶血作用。無論是有核的鯉魚血或雞血的紅細胞，還是無核的人血紅細胞，在接觸茶皂素的一端均產生溶血；處于正在溶血狀態和未溶血的紅細胞的交界面，可以清楚的看到茶皂素破壞紅細胞膜的狀況：首先是破壞膜，隨之細胞質外滲（見圖版Ⅰ：4），最終整個紅細胞的膜全部被破壞，有核的紅細胞（如雞、鯉魚的紅細胞），僅剩下細胞核，無核的紅細胞（人血）則呈一片膠質狀態。而對血液中的白細胞卻沒有這種作用，如從圖版Ⅰ：5、6溶血后的鯉魚和雞的血膜涂片中，可以看到它們仍安然無恙。 有關蝦類血液的資料極少，在對其血細胞的形態缺乏感性認識情況下，進行茶皂素對蝦類離體血液作用的研究，首先是從判別蝦血細胞入手的。在取出注射活蝦心臟后（此時的心臟仍處于博動狀態），分別對其外圍組織液、心臟肌肉及心臟針刺流出液進行涂片、染色和固定，在確定確定血液及血細胞的基礎上進行茶皂素處理。 用茶皂素對蝦心臟血液涂片作涂布試驗發現，茶筇素對蝦血細胞并不產生破壞作用，與鯉魚血膜相比，蝦血涂片則容易被茶皂素溶液所稀釋，亦即蝦血溶液的凝固性不及鯉魚血。 2．茶皂素對魚類的毒性作用 上述試驗結果表明，茶皂素的溶血作用必須是在血液接觸藥劑的情況下才能產生，那么茶皂素又是進入魚體的呢？ 通過不同條件下魚體組織的顯微觀察，結果表明，茶皂素的魚毒作用首先是破壞魚鰓組織，然后由鰓進入微血管。未經茶皂素處理的活魚鰓和自然死亡的魚的鰓是鮮紅的，而接觸茶皂素后的魚鰓微血管則變成黑色。從顯微觀察上可以看到，由單層細胞組成的魚鰓上皮細胞遭到了破壞，微血管外露。并且，茶皂素的這種作用隨著其濃度的提高而增強，當濃度提高至100mg/L時，中毒死亡的魚鰓僅留下微血管道，上皮細胞已完全遭破壞，這時魚的中毒死亡速度也加快，如鱉條魚，茶皂素的濃度在10mg/L時需2—3h才中毒死亡，當濃度提高到100mg/L時則只需20—30min就中毒死亡。 對8—10mm的魚苗進行顯微觀察顯示，正；铘~的魚體是透明的，并可見到心臟部位的血液的鮮紅的，而經茶皂素培養中毒后的魚體，其心臟部位已逐漸變黑，且不透明，說明已產生溶血。其次，從尾部顯微照相記錄發現，茶皂素的毒性對尾部最外延表皮細胞也產生破壞作用，引起尾端血管向外開放和血液外流。 魚鰓上皮細胞的破壞，導致茶皂素與血液接觸，從而引起紅細胞的溶解。從圖版Ⅱ：1、2比較中可見，在茶皂素的作用下，鰓血中的紅細胞已剩不多，基本上多是細胞核。中毒后的魚的心臟血液觀察結果亦然，出現了不少被溶血后的紅細胞核，且細胞核的數量隨中毒程度的加深而增加。 以上結果表明，茶皂素是通過破壞魚鰓的上皮組織，與魚的血液接觸產生溶血中毒，并且隨著呼吸作用和血液循環，導致心臟血液溶血而使魚中毒死亡。 3.茶皂素對對蝦影響 利用與魚相同的研究方法，對對蝦進行了試驗，只是所用水質為15‰的鹽水。從培養中存活狀況來看，茶皂素濃度為20mg/L條件下經3h，對蝦無異，F象。經解剖，蝦鰓的顯微觀察顯示，處理與對照間沒有差別。 對鰓魚和心臟血液進行涂片觀察比較，結果也無異常變化。 從上述三個方面的研究結果，基本上可以看出茶皂素的魚毒作用：從溶血性方面看，主要是破壞紅細胞膜，引起細胞質外滲，而對紅細胞以外的血細胞未發現這種作用；對魚類而言，首先是對鰓的上皮細胞產生嚴重的破壞作用（這與Vogel G的試驗結果一致），從而使鰓微血管外露，茶皂素有了與血液接觸的機會，引起溶血。所以，茶皂素的毒性包括魚毒和溶血兩個方面。顯而易見，茶皂素對同樣以鰓為呼吸器官的甲殼類的對蝦卻無此作用，其原因也可能有兩個方面：一方面，與血液的結構有關，魚的血液中攜氧載體為血紅素，核心為Fe++,而對蝦血液攜氧載體為血蘭素，其核為Cu++ ,另一方面，與蝦鰓的結構有關，因為蝦鰓是從角質層發育而來的一個角質層區，表皮的主要成份是幾丁質和蛋白質，而幾丁質（C32H54N4O21）n 是復雜的含氮多糖類，與魚鰓的結構及成分截然不同。 4．茶皂素的溶血效應 溶血效應通常用兩種方法觀察：一是溶血曲線，二是時間—稀釋率曲線。 采用721分光光度計，波長510nm,靈敏度4，比色皿3㎝。血液濃度50%（以標準血球懸浮液計），對七種不同濃度的溶血率及其時間—稀釋率進行了測定。結果表明，各處理的溶血趨勢一致，250、100、50、30和25mg/L等5個濃度的溶血率曲線，均呈“S”形，說明其溶液血不是勻速的，而是在某一時間內特別快；稀釋倍數越小，溶液血速度越快。例如稀釋至40000倍（250 mg/L）全溶時間需37min, 稀釋倍數為4000（250 mg/L）時僅需5min。 茶皂素的溶血當量測定，是指從定量的角度推斷茶皂素的溶血性能。試驗分別從茶皂量和血液體積均為變量、血量為定值和茶皂素為變量、茶皂素為定量和血量為變量3個方面進行測定。試驗條件：波長480nm,靈敏度2，比色皿1㎝，蒸餾水作空白。 從3份圖表分析，無論怎樣改變試驗條件，茶皂素的溶血性能均非常穩定，即：（1）當溶液中茶皂素I含量在10—20mg/L范圍時，溶血速度加劇，即“S”形的突變階段，以10 mg /L時為折點，故溶血指數為10000，這一結果與上述時間—稀釋率曲線測定結果相同。從溶液溶血后的沉淀觀察發現，當濃度小于10 mg /L時，沉淀帶紅色，文明有 殘剩的未溶血的紅細胞（完全溶血時沉淀為白色）。 (2)達到每每毫升標準血球懸殊浮液完全溶解，約需茶皂素I30μɡ。 （3）當血溶液中的茶皂素含量已達到完全溶血時，每毫升血液所產生的離子濃度的E值是相同的，各處理溶血后的E值處在同一直線上，如果茶皂素含量未能達到全溶時，E值就偏離直線，在圖3上將偏離直線的3號、2號、1號的3個處理點作水平線，與標準曲線相交，通過交點作垂線，在x軸上可以找出3號的溶血量為12.7ml，2號的溶血量為12.3ml，1號的溶血量為1.65ml。根據上述實驗數值，可推算出試驗1—10號每毫克茶皂素的溶血量分別為8.26、30.77、21.19、14.93、10.0、6.67、4.28、2.50、1.10ml。其中在2號處出現極大值30.77ml，精確地說，這個極大值在1—2號之間，即10—20mg/L間，說明茶皂素在某一濃度時發揮的作用最大。 |
